43. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN MONOAMIN OXIDASE B NGƯỜI TRÊN PICHIA PASTORIS
Nội dung chính của bài viết
Tóm tắt
Mục tiêu: Khảo sát và xác định các điều kiện tối ưu cho việc biểu hiện enzyme monoamine oxidase B (MAO-B) người tái tổ hợp trên Pichia pastoris KM71.
Phương pháp nghiên cứu: Chủng P. pastoris KM71 mang gen mã hóa MAO-B người được sử dụng. Các điều kiện nuôi cấy và cảm ứng được khảo sát bao gồm các loại môi trường tăng sinh khối (BMG, BMGY), môi trường cảm ứng (BMM, BMMY), nồng độ methanol (0,25%, 0,5%, 1%) và thời gian cảm ứng (24 - 144 giờ). Điều kiện phá tế bào bằng phương pháp cơ học với hạt thủy tinh cũng được tối ưu hóa. MAO-B được tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion (HiTrap Q FF) và hoạt tính được xác định bằng phương pháp đo quang với cơ chất benzylamin.
Kết quả: Môi trường tối thiểu BMG - BMM cho hoạt tính enzyme cao hơn môi trường phức hợp BMGY - BMMY. Nồng độ methanol 0,5% và thời gian cảm ứng 24 giờ cho hoạt tính MAO-B cao nhất. Điều kiện phá tế bào tối ưu là 6 phút phá, 10 phút nghỉ, trong 6 chu kỳ. MAO-B được tinh chế thành công, rửa giải chủ yếu ở nồng độ 30% và 40% HIGH-QB và enzyme tinh chế có hoạt tính khoảng 2977 U/L.
Kết luận: Nghiên cứu đã biểu hiện thành công enzyme MAO-B người tái tổ hợp có hoạt tính trên chủng P. pastoris KM71 và xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình biểu hiện, phá tế bào và tinh chế bước đầu, tạo tiền đề cho các ứng dụng tiếp theo.
Chi tiết bài viết
Từ khóa
Monoamin oxidase B người, Pichia pastoris, tái tổ hợp.
Tài liệu tham khảo
[2] Bill RM. Playing catch-up with Escherichia coli: using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in microbiology. 2014;5:85.
[3] Invitrogen L. User manual-EasySelect TM Pichia Expression Kit. Cat; 2010.
[4] Matthews CB, Kuo A, Love KR, Love JC. Development of a general defined medium for Pichia pastoris. Biotechnology and Bioengineering. 2018;115(1):103-13.
[5] Hu R, Lan D, Cui R, Hong H, Niu Y, Wang Y. Controlling methanol feeding for recombinant protein production by Pichia pastoris under oxidation stress in fed-batch fermentation. 2020.
[6] Karbalaei M, Rezaee SA, Farsiani H. Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins. Journal of cellular physiology. 2020;235(9):5867-81.
[7] Massey V. The chemical and biological versatility of riboflavin. Biochemical Society Transactions. 2000;28(4):283-96.